ELISA检测原理:

科捷斯（上海）生物科技有限公司（Cortes (Shanghai) Biotechnology Co., Ltd.）所生产的 ELISA 试剂盒采用“夹心法”，将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的靶蛋白，生物素化的检测抗体与靶蛋白结合， SABC 复合物与生物素化检测抗体结合，形成免疫复合物，加入TMB 显色液后，若反应孔中有靶蛋白则显蓝色，加入终止液变黄色，检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在 450 nm 处测 OD 值，靶蛋白浓度与OD 值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出标本中靶蛋白的浓度。

标本收集与试剂准备:

一、血清、血浆样本收集应使用一次性的无热原，无内毒素试管（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝均可），血清、血浆避免使用溶血，高血脂标本，标本悬浮物应离心去除，使标本清澈透明。待测样本应尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-80℃）保存，避免反复冻融。

二、洗涤液配置：用蒸馏水1:20稀释（例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的蒸馏水）

三、标准品配制：取8个1.5ml离心管，分别标注S1,S2,S3,S4,S5,S6,S7,blank,第一管S1中加入标准品/样品稀释液900ul，第二至第八管中分别加入标准品/样品稀释液200ul，在第一管中加入(500ng/ml)标准品溶液100ul置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管，如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出200ul弃去，第八管为空白对照。

四、生物素化抗体工作液配置:使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。

五、TMB显色液的配置：使用前10分钟，将TMB显色液A液和B液1：1混合，避光放置备用。

六、如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值，建议重新检测，请根据实际情况，适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。

检测程序:

一、加样∶空白孔加入50ul标准品/样品稀释液，其余孔各加入标准品或待测样品50ul，将反应板混匀后置37℃，40分钟。

二、洗板∶用1×洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，每孔加入1×洗液350ul，每次震荡/浸泡1-2分钟，向滤纸上印干。

三、空白孔加入100ul生物素化抗体稀释液，其余孔各加入1*的生物素化抗体工作液100ul，混匀后置37℃，30分钟。

四、洗板︰同上。

五、每孔加入SABC复合物工作液10Oul，混匀后置37℃，20分钟。

六、洗板︰同上。

七、每孔加入提前配置好的TMB混合液100ul，混匀后置37℃暗处反应10-20分钟(具体显色时间根据显色结果而定)。

八、每孔加入100ul终止液，混匀，30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

 注意事项:

一、在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测，每次检测都应做标准曲线。

二、洗涤过程很关键，洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高，从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶属于正常现象，37℃水浴使结晶完全溶解后再配制洗涤液。

三、检测时所有试剂都要恢复到室温，板条开封后剩余板条需封好，放回袋中1个月内用完。

四、试剂盒使用超敏TMB溶液，显色过深时会出现沉淀状，属正常现象，混匀即可，不影响结果判读。

五、说明书以试剂盒内纸质版为准,本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断，适用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清及其它生物体液。

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