双抗夹心法酶联免疫分析：
标准品和样品中的抗原被捕获的抗体和对该抗原特异的检测抗体夹在中间。检测抗体被链霉亲和素-过氧化物酶偶联物识别。洗去所有未结合的物质并加入过氧化物酶底物。停止显色并测量颜色强度。颜色的强度与样品中存在的抗原浓度成正比。
双抗夹心法ELISA试剂盒操作流程：
特定的捕获抗体包被在96孔板上，标准品和样品被移入孔中；标准品和样品中的目标蛋白与固定化抗体结合；洗涤孔，然后加入生物素标记的检测抗体；洗去未结合的生物素化抗体后，将HRP偶联的链霉亲和素移至孔中，然后加入比色底物溶液。
双抗夹心法的特点：
①可逆性：抗原抗体结合是动态平衡过程
②特异性强：抗原抗体化学结构互补，高度特异
③高灵敏度：标记的免疫敏感度高
④最适比例：抗原抗体的含量应保持在最适比例
⑤大批量检测：适用于大批量检测，广泛用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等
材料与仪器：
（1）包被缓冲液（pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液）。
（2）洗涤缓冲液（pH 7.4，0.15 M PBS）。
（3）稀释液。
（4）终止液（2 M H2SO4）。
（5）底物缓冲液（pH 5.0）。
（6）四甲基联苯胺（TMB）使用液。
（7）2，2＇-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液。
（8）抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。
（9）标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。
（10）96 孔聚苯乙烯塑料板（酶标板）。
步骤：
(1) 包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1～10 g/mL。在酶标板反应孔中加 0.1 mL，4 ℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板 3 次，每次 3 min
(2) 加样：加一定浓度稀释的待检样品 (同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照） 0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，37 °C，1 h。用洗涤缓冲液洗板 3 次，每次 3 min。
(3) 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体 （经滴定后的稀释度） 0.1 ml。 37 °C，0.5～1 h，用洗涤缓冲液洗板 3 次，每次 3 min。
(4) 加底物液显色：于各反应孔中加入现配的 TMB 底物溶液 0.1 mL，37 °C，10～30 min。
(5) 终止反应：于各反应孔中加入终止液 0.05 mL。
(6) 结果判定：将酶标板在酶标仪上，于 450 nm (若 ABTS 显色，读 410 nm)，读数，输出到 Excel 中。
